Préparez-vous à vivre une histoire si épique qu'elle ne pourrait se dérouler que dans les couloirs du plus grand musée du monde, la Smithsonian Institution. Larry Daley, gardien de musée devenu entrepreneur, découvre que ses expositions préférées et certaines de ses meilleurs amis du Musée d'histoire naturelle de New York sont expédiées vers les archives du Smithsonian. Larry reçoit un appel de détresse du cow-boy miniature Jedediah, lui annonçant que le dirigeant égyptien Kahmunrah et un trio de sbires odieux - à savoir Ivan le Terrible, Napoléon et Al Capone - complotent pour s'emparer du musée, puis du monde. En se dirigeant vers la capitale nationale, Larry est clairement dépassé. Mais avec quelques nouveaux amis impressionnants, dont l'irrépressible Amelia Earhart, ainsi que ses amis familiers Teddy Roosevelt et Octavius, Larry ne reculera devant rien pour restaurer le Smithsonian avant l'aube.